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Circulating free DNA甲基化解決方案

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應用案例

 

提供cfDNA甲基化全方位技術解決方案

 

cfDNA (circulating-free cell DNA), 又稱循環 DNA 或無細胞DNA, 是指存在于血漿或血清的細胞外DNA

ctDNAcirculating tumor DNA)攜帶了腫瘤基因組一定的突變信息(SVindelCNV)

還攜帶表觀修飾信息5mC甲基化和5hmC羥甲基化及結構信息(片段長度、斷裂特征等)

其中DNA甲基化5mC修飾具有獨特的應用價值,廣泛用于腫瘤疾病早篩早診、復發預后等應用

 

 

 

 

基于cfDNA甲基化biomarker篩選技術路線

潛在甲基化biomarker篩選步驟,結合樣本及成本的實際情況,按照以下3種方式進行:

1、以現有的TCGA甲基化芯片數據庫進行篩選潛在的biomarker及建模;

2、從腫瘤組織樣本入手,篩選腫瘤特異性的biomarker,推薦最高性價比的RRBS方案;

3、直接以血漿/血清cfDNA樣本進行WGBS測序篩選biomarker及建模。

 

 

在驗證步驟,對潛在的biomarker及模型的驗證,

通常采用靶向甲基化Panel對大樣本血漿/血清cfDNA的臨床驗證。

 

 

完整解決方案,服務每一個項目

艾斯基因專注表觀組學10年,提供專業的DNA甲基化完整解決方案;

已經完成3000+例樣本cfDNA甲基化項目經驗;

解決從血液采集保存、cfDNA分離提取(>90%得率)

低至15ng輸入量的微量全基因組甲基化文庫構建,

cfDNA靶向甲基化Panel定制測序一整套核心技術方案;

全方位助力cfDNA甲基化biomarker篩選及轉化應用。

 

 

 

技術方案及樣本要求

樣本/文庫類型

樣本要求

850K甲基化芯片 (組織樣本)

總量≥ 1ug; 濃度≥ 30ng/ul; 基于Qubit定量

WGBS/RRBS (組織樣本)

總量≥ 1ug; 濃度≥ 30ng/ul; 基于Qubit定量

cfDNA WGBS (血漿樣本)

建議提供1-4ml血漿/血清, 或者>15ng cfDNA

甲基化Panel (血漿樣本)

建議提供1-4ml血漿/血清, 或者>15ng cfDNA

備注用封口膜密封樣品; 干冰運輸

 

 

cfDNA樣本準備注意事項

在體內cfDNA在血漿里核酸酶的作用下,不斷降解消失,

同時新的ctDNAcfDNA進入血漿中,維持一定的動態和半衰期;

抽血離體之后ctDNA會繼續降解、含量逐步減少,

而來自白血細胞的cfDNA持續進去血漿,進而稀釋ctDNA濃度,降低檢測信號。

因此,在采血、血漿分離及保存運輸,每一步操作都會影響數據的質量

 

抽血及暫存注意事項

EDTA抗凝管

2-8度冰箱暫放;在8小時內低溫離心分離血漿

Streck等采血管

2-8度冰箱或者常溫暫放;在48小時內離心分離血漿

注意:全血樣本在分離出血漿之前,千萬不要冷凍保存

血漿分離

采取兩輪離心分離血漿,4℃條件下以 1600g 離心10min

4℃條件下以 16000g 離心10min

要求EDTA抗凝管采血管需要低溫條件離心;

Streck等采血管建議低溫離心,也可以常溫離心,不受到影響

保存及運輸

分離的血漿存放于-80℃冰箱保存(3年內都可以); 使用干冰運輸。

cfDNA提取產量

cfDNA的含量存在較大的波動及異質性;

一般正常人及腫瘤早期, 5-15ng/ml血漿;

腫瘤晚期或者化療等病人, cfDNA濃度顯著提高

 

為了結果的穩定性和一致性,

我們建議使用Streck等采血管替代普通的 EDTA抗凝管,

對于合作項目,艾斯基因免費提供專門的采血管!

 

 

未找到相應參數組,請于后臺屬性模板中添加

 

目前基于cfDNA甲基化biomarker篩選技術路線,結合樣本及成本的實際情況,按照以下3種方式進行

 

技術路線1:以現有的TCGA甲基化芯片數據庫進行篩選潛在的biomarker及建模

案例分析:循環腫瘤DNA甲基化biomarker用于肝癌診斷和預后

Circulating tumour DNA methylation markers for diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma. Nat Mater. 2017;16(11):1155-1161.

本課題通過TCGA數據庫篩選401個甲基化Biomarker, 1933例血漿中進行基于靶向亞硫酸鹽測序(Targeted Bisulfite Sequncing, TBS) ,通過與臨床樣本信息進行關聯分析,最終篩選了10HCC診斷和8HCC預后預測的甲基化Biomarker.

 

 

 

技術路線2從腫瘤組織樣本入手,篩選腫瘤特異性的biomarker,推薦最高性價比的RRBS方案

案例分析:血清游離DNA甲基化biomarker用于乳腺癌轉移早期篩查

Methylation patterns in serum DNA for early identification of disseminated breast cancer. Genome Med. 2017;22;9(1):115.

本課題通過RRBS檢測了31個樣本,其中癌組織(n=8)和白細胞(n=23)DNA甲基化,篩選出18個癌癥特異的DMR, 進一步通過TBS (Targeted Bisulfite Sequencing) 在兩個樣本庫(>1000)的血漿cfDNA中驗證,找到血清EFC#93用于早期識別彌散性乳腺癌的biomarker.

 

 

 

技術路線3:直接以血漿/血清cfDNA樣本進行全基因組甲基化測序篩選biomarker及建模

案例分析:血漿DNA甲基化分析提示EBV病毒相關疾病的病因

Methylation analysis of plasma DNA informs etiologies of Epstein-Barr virus-associated diseases. Nat Commun. 2019;10(1):3256

本研究通過對鼻咽癌 (NPC, N=15)EBV相關性淋巴瘤 (n=9) 和傳染性單核細胞增多癥患者 (N=5) 的血漿游離cfDNA進行WGBS測序分析,發現EBV DNA甲基化圖譜呈現疾病相關模式。這表明在鼻咽癌診斷中進行血漿EBV DNA甲基化分析具有重要的潛力。

 

 

 

EBV相關疾病的特異性血漿EBV DNA甲基化聚類

 

 

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